PCR實(shí)驗(yàn)是基于核酸水平的微觀樣本實(shí)驗(yàn)，而這些微觀樣本對(duì)溫度、ph值等實(shí)驗(yàn)環(huán)境非常敏感，在盡力維護(hù)樣本和保存環(huán)境的同時(shí)，防止核酸樣本污染也成為不可避免的話題。“易查不易察”，污染來(lái)的悄無(wú)聲息，今天給大家簡(jiǎn)單介紹一下PCR實(shí)驗(yàn)室的主要污染來(lái)源、實(shí)驗(yàn)中如何避免和減少污染的可能性及實(shí)驗(yàn)發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。
一、PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來(lái)源
1、樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)外溢；不同樣本移液時(shí)忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時(shí)消毒滅菌；不同樣本同時(shí)開(kāi)蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。
2、實(shí)驗(yàn)試劑污染：在試劑配制過(guò)程中，摻入核酸模板導(dǎo)致污染。
3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開(kāi)蓋。
4、克隆質(zhì)粒污染：作為陽(yáng)性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
二、PCR實(shí)驗(yàn)室的防污染方法
1、合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品，包括移液器等器具應(yīng)專用，空氣、物品流向依次為：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。
2、清潔的實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實(shí)驗(yàn)耗材應(yīng)一次性使用。
三、正確的實(shí)驗(yàn)操作
1、實(shí)驗(yàn)應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機(jī)、各量程的移液器和其他必須物品。
2、實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中選擇最合適尺寸的手套并能及時(shí)更換，在進(jìn)出不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域或進(jìn)行模板操作后都應(yīng)更換實(shí)驗(yàn)服、口罩、帽子及手套，以避免不同實(shí)驗(yàn)區(qū)交叉污染。
3、裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開(kāi)之前應(yīng)先瞬時(shí)離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險(xiǎn)。謹(jǐn)慎開(kāi)啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。
4、吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。
5、PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)。多樣本PCR反應(yīng)時(shí)，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸，請(qǐng)勿同時(shí)開(kāi)蓋，盡量保證單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作。
6、實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同處。
7、PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)完成后及時(shí)將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
四、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，全程質(zhì)控實(shí)驗(yàn)過(guò)程，驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
五、PCR實(shí)驗(yàn)室的污染應(yīng)急處理方法
1、若核酸樣本溢出：應(yīng)立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動(dòng)紫外車定點(diǎn)照射1小時(shí)。
2、其他不明情況污染：應(yīng)暫停所有實(shí)驗(yàn)操作，清理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品，尋找污染來(lái)源。同時(shí)加大實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有表面（臺(tái)面、地面及墻面） 進(jìn)行消毒，用75%酒精空中噴霧。開(kāi)啟紫外消毒裝置，延長(zhǎng)紫外照射時(shí)間（4小時(shí)以上）。以上措施每日進(jìn)行，直至污染消除；用新試劑及確認(rèn)無(wú)污染的器材進(jìn)行原污染項(xiàng)目的試劑空白檢測(cè)，連續(xù)3次均陰性后方可進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。
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